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                            第三代高通量測序平臺

                            第三代高通量測序平臺 




                            第三代高通量測序平臺

                            PacBio RS IIPacific Biosciences公司研發的單分子實時測序系統(Single Molecule Real Time, SMRT),其專利的SMRT Cell含有15,000個納米級的零模波導孔(zero-mode waveguides, ZMWs),每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序,并實時檢測插入堿基的熒光信號。

                            技術特點

                            超長讀長:最長可達到40kb,提高拼接準確率和完整性;測序時間短:從DNA到數據只需10個小時;準確率高:對基因組組裝和基因組變異檢測,可以最多達到99.999%的準確率;敏感性強:可以檢測頻率在0.1%的minor variants;DNA起始量較低,最低只需要250ng;無PCR擴增偏好性:樣本不需要進行PCR擴增,避免了覆蓋度不均一和PCR artifacts;最小的GC偏好性(GC bias):在極端高GC和極端低GC區域,可以輕松測定,從而保證序列的均勻覆蓋度。

                            數據產出

                            試劑盒

                            平均讀長

                            數據量/SMRT Cell

                            P6-C4 Chemistry

                            10Kb-14Kb

                            500Mb-1Gb

                            P5-C3 Chemistry

                            8-10Kb

                            ~250Mb

                            P4-C2 Chemistry

                            5.5-6Kb

                            ~200Mb

                            應用領域

                            1)全基因組de novo測序

                            與二代測序最高不超過1Kb的讀長相比,PacBio RS II的長讀長將有效解決短序列數據的拼接難題。同時,與二代測序的模板樣品需要擴增相比,PacBio RS II無需擴增可直接對單個分子進行測序,有效避免了PCR擴增偏好性和GC偏好性,PacBio RS II可輕松跨越GC含量異常(過高或過低)及高度序列重復的區域,實現序列覆蓋的完整性和均一性

                            2)基因組草圖的優化或基因組完成圖繪制

                            對前期已開展測序的動植物、微生物等基因組結合三代長讀長測序數據進行完善和提升。針對前期已經開展全基因組測序,獲得基因組草圖的動植物、微生物等,可以結合PacBio RS II平臺長讀長reads進行補充,從而快速獲得前期沒有測得的信息及提升基因組的完整度。另外還可以針對前期沒有檢測獲得的結構變異信息(structural-variation events)、串聯重復序列信息(tandem duplication)、易位信息(Inversion)等。尤其在微生物基因組完成圖的繪制中,可在一天之內、成本低于$1,000即可將基因組完善獲得0 gap contig

                            3)全長轉錄本測序

                            PacBio RS II的長讀長可實現全長轉錄本測序,并使基因可變剪接形式的識別成為可能,因此可以對新基因及其isoform進行更全面的研究。同時,長讀長不再需要對RNA-Seqreads進行組裝,因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進行更全面的注釋,用以改進參考基因組中的基因注釋信息。

                            4)宏基因組測序

                            長讀長reads能夠更為精準地鑒定水體、土壤、腸道等生境中微生物的種類的鑒定,能夠更加快捷地獲得更多微生物物種的全基因組序列。

                            516S rDNA全長測序

                            PacBio RS II的平均讀長為8-10Kb,而16S rDNA長度大約為1540bp,因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列。

                            6)細胞器基因組測序

                            葉綠體基因組和線粒體基因組序列都包含重復序列、反向重復序列等復雜結構,PacBio RS II的長讀長可直接跨越這些區域獲得這些細胞器的全基因組序列信息等,基因組組裝不依賴于是否有近緣物種的線粒體和葉綠體基因組信息等、重測序能夠檢測到全面的SNPsindel信息。

                            7)全基因組重測序&稀有變異鑒定

                            PacBio RS II長讀長測序readsGC偏好,能夠全面獲得基因組的遺傳變異,包括SNPs的鑒定到CNVSV結構變異等,可運用至人類癌癥基因組重測序等。PacBio RS II平臺10 小時即可完成測序,可應用至需要快速反饋的臨床檢測中,如細菌感染疾病中細菌的鑒定、病毒的鑒定等,取樣開展重測序和目前已有的細菌、病毒基因組數據庫進行比對鑒定即可。

                            8)表觀遺傳學

                            PacBio RS II利用測序過程聚合酶反應的動力學變化,首次實現對堿基修飾進行直接測序。當堿基有額外修飾時,DNA聚合酶的合成速度會減慢,對應的信號會被檢測出來。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的停頓模式”PacBio RS II產生微小差異,最終反映到熒光脈沖信號的間隔上。除了甲基化修飾,還可以檢測5-hC5-hmU5-hU1-mA6-mA8-oxoABPDE6-mT6-mG等堿基修飾,甚至可以鑒別傳統亞硫酸氫鹽測序法無法區分的甲基化修飾和羥甲基化修飾。PacBio平臺可以在測序的同時即可檢測表觀遺傳學修飾信息,只需對測序數據選擇合適的軟件即可分析堿基修飾信息。

                            第三代高通量測序平臺
                            技術特點
                            測序讀長可達到8-12kb;完成一輪測序反應可產生160G數據;測序系統包含16個SMRT cell測序模塊,每個SMRT cell可產生5-10G數據;每個SMRT cell包含100萬個零模波導孔,每個零模波導孔為一個測序單元,完成一條DNA分子的測序反應。
                            應用領域

                            1)全基因組de novo測序

                            與二代測序最高不超過1Kb的讀長相比,PacBio Sequel的長讀長將有效解決短序列數據的拼接難題。同時,與二代測序的模板樣品需要擴增相比,PacBio Sequel無需擴增可直接對單個分子進行測序,有效避免了PCR擴增偏好性和GC偏好性,PacBio Sequel可輕松跨越GC含量異常(過高或過低)及高度序列重復的區域,實現序列覆蓋的完整性和均一性

                            2)基因組草圖的優化或基因組完成圖繪制

                            對前期已開展測序的動植物、微生物等基因組結合三代長讀長測序數據進行完善和提升。針對前期已經開展全基因組測序,獲得基因組草圖的動植物、微生物等,可以結合PacBio Sequel平臺長讀長reads進行補充,從而快速獲得前期沒有測得的信息及提升基因組的完整度。另外還可以針對前期沒有檢測獲得的結構變異信息(structural-variation events)、串聯重復序列信息(tandem duplication)、易位信息(Inversion)等。尤其在微生物基因組完成圖的繪制中,可在一天之內將基因組完善獲得0 gap contig

                            3)全長轉錄本測序

                            PacBio Sequel的長讀長可實現全長轉錄本測序,并使基因可變剪接形式的識別成為可能,因此可以對新基因及其isoform進行更全面的研究。同時,長讀長不再需要對RNA-Seqreads進行組裝,因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進行更全面的注釋,用以改進參考基因組中的基因注釋信息。

                            4)宏基因組測序

                            長讀長reads能夠更為精準地鑒定水體、土壤、腸道等生境中微生物的種類的鑒定,能夠更加快捷地獲得更多微生物物種的全基因組序列。

                            516S rDNA全長測序

                            PacBio Sequel的平均讀長為8-12Kb,而16S rDNA長度大約為1540bp,因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列。

                            6)細胞器基因組測序

                            葉綠體基因組和線粒體基因組序列都包含重復序列、反向重復序列等復雜結構,PacBio Sequel的長讀長可直接跨越這些區域獲得這些細胞器的全基因組序列信息等,基因組組裝不依賴于是否有近緣物種的線粒體和葉綠體基因組信息等、重測序能夠檢測到全面的SNPsindel信息。

                            7)全基因組重測序&稀有變異鑒定

                            PacBio RS II長讀長測序readsGC偏好,能夠全面獲得基因組的遺傳變異,包括SNPs的鑒定到CNVSV結構變異等,可運用至人類癌癥基因組重測序等。PacBio Sequel平臺10 小時即可完成測序,可應用至需要快速反饋的臨床檢測中,如細菌感染疾病中細菌的鑒定、病毒的鑒定等,取樣開展重測序和目前已有的細菌、病毒基因組數據庫進行比對鑒定即可。

                            8)表觀遺傳學

                            PacBio Sequel利用測序過程聚合酶反應的動力學變化,首次實現對堿基修飾進行直接測序。當堿基有額外修飾時,DNA聚合酶的合成速度會減慢,對應的信號會被檢測出來。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的停頓模式”PacBio Sequel產生微小差異,最終反映到熒光脈沖信號的間隔上。除了甲基化修飾,還可以檢測5-hC5-hmU5-hU1-mA6-mA8-oxoABPDE6-mT6-mG等堿基修飾,甚至可以鑒別傳統亞硫酸氫鹽測序法無法區分的甲基化修飾和羥甲基化修飾。PacBio Sequel平臺可以在測序的同時即可檢測表觀遺傳學修飾信息,只需對測序數據選擇合適的軟件即可分析堿基修飾信息。

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