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                            微生物基因組從頭測序

                            微生物基因組從頭測序 




                            簡介:

                            微生物廣泛存在于自然界中,與人類的生產和生活息息相關。微生物生物多樣性豐富,基因組具有相對較小、重復序列較高、易于突變等特點,因此很必要對微生物進行全基因組測序,而且同動植物相比較在時間和成本上也容易實現。目前,全基因組測序成為微生物遺傳進化、疾病預防控制、生物工程技術等方面重要的研究和開發手段。

                            一、技術路線
                             Illumina MiSeq

                            二、生物信息分析

                            1. 原始數據整理、過濾及質量評估

                            2. Survey 分析 (基因組大小估計)

                            3. 基因組拼裝與分析:
                            序列拼裝
                             拼裝統計(N20N50N90、總拼接長度、最長拼接長度、GC含量、總序列數量、>1 kb序列數量、N數量、N比例、測序深度等)
                            測序深度分布圖
                            基因組圈圖繪制(僅適用于完成圖)

                            4. 功能元件分析

                            5. 蛋白編碼基因功能注釋:
                            ♦序列比對 (數據庫:refseq)
                            ♦GO注釋 (數據庫:refseq)
                            ♦COG注釋 (數據庫:eggNOG)
                            ♦KEGG注釋(KAAS,BBH)

                            6 比較基因組學分析:
                            基因家族分析(共有基因,特有基因分析)
                            共線性
                            基于 16s rDNA 18s rDNA的進化分析

                            三、結果展示

                            四、樣品要求
                            1、細菌:Miseq DNA PE文庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥6 μg(熒光定量);Miseq DNA MP文庫濃度≥40 ng/ μl,總量≥12 μg(熒光定量);454 DNA庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥3 μg(熒光定量)。電泳檢測無明顯RNA條帶,基因組條帶清晰、完整,主帶應在100 kb以上,DNA無降解,無污染提供菌粉>1 g,菌液>5 ml,盡量提供較多量,不同的物種DNA提取產量有差異。

                            2、真菌:Miseq DNA PE 文庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥6 μg(熒光定量);Miseq DNA MP 文庫濃度≥40 ng/ μl,總量≥12 μg(熒光定量);454 DNA庫濃度≥20 ng/ μl,總量≥3 μg(熒光定量)。提供組織樣品應>1 g,盡量提供較多量,不同的物種DNA提取產量有差異。

                            3、樣品保存期間切忌反復凍融。 

                            4、送樣管務必標清樣品編號,管口使用Parafilm 膜密封。

                            5、提供DNA電泳檢測照片,用自封袋密封后隨樣品一起送樣。

                            五、測序優勢

                            1.平臺優勢:擁有ABI 3730 XLRoche 454 FLX+Illumina MiseqIllumina HiSeq2000高通量測序平臺,多種平臺聯合應用,優勢互補,滿足客戶不同需求。

                            2.技術團隊:擁有經驗豐富的技術人員,專業的生物信息團隊和大型計算機服務系統,可提供個性化生物信息分析服務。

                            3.項目周期:個人型測序平臺,無需長時間湊樣上機,極大縮短項目周期。


                            經典案例1:
                             
                            海豚鏈球菌全基因組測序

                            背景海豚鏈球菌是革蘭氏陽性致病菌,不僅能夠感染淡水、咸水魚類,而且能夠感染人類,被認為是對水產養殖業發展影響最大的致病菌之一。

                            目的運用Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq平臺對海豚鏈球菌SF1進行全基因組測序,從而對海豚鏈球菌SF1的蛋白編碼基因,信號通路轉導,碳水化合物代謝,以及如何對抗宿主免疫應答反應等進行研究分析,了解其致病機制。

                             

                            結果海豚鏈球菌SF1的全基因組大小為2.15 MbGC%含量為36.7%,共注釋到2125個蛋白質編碼基因,預測到45 tRNA基因和12 rRNA基因。CRISPR/Cas系統是目前發現存在于大多數細菌與所有的古菌中的一種后天免疫系統,以消滅外來的質體或者噬菌體,并在自身基因組中留下外來基因片段作為“記憶”,本研究在SF1中發現一個CRISPR位點和4Cas基因。通過進一步的蛋白質組學實驗檢測到SF121個被宿主血清誘導表達的分泌蛋白,為了進一步驗證這些蛋白的功能,經過免疫效果實驗顯示其中的兩個候選蛋白可以作為制備防治該種魚病的疫苗使用。本研究結果為其他類型的海豚鏈球菌的研究提供了一個分子生物學理論基礎,尤其是在對海豚鏈球菌的發病機制和對水產品疾病控制方面具有重要意義。

                            原文索引:[Zhang B C, et al. Streptococcus iniae SF1: complete genome sequence, proteomic profile, and immunoprotective antigens[J]. PloS one, 2014, 9(3): e91324.]

                             
                             經典案例2:
                            條石鯛虹彩病毒全基因組測序

                            背景虹彩病毒科是雙鏈DNA病毒,包括5個病毒屬,其中細胞腫大病毒屬病毒可導致許多種水產養殖魚類致病,因此對水產養殖業造成很大的威脅。

                            目的 RBIV-C1是從條石鯛中分離出來的虹彩病毒細胞腫大病毒屬,通過對RBIV-C1病毒進行全基因組測序,全面掌握該病毒的全基因組信息,從而了解其基因表達模式,同時通過與其他已有基因組序列信息的虹彩病毒進行比對,探究其變異來源,并尋找RBIV-C1的特異性,為RBIV-C1病毒菌株的的鑒定尋找新的方法和依據,為魚病的防治工作尋找新的思路。

                            結果條石鯛虹彩病毒RBIV-C1的全基因組大小為112.3 kbGC%含量為55%。同時發現RBIV-C1中有4584個簡單重復序列,其中89.8%的簡單重復序列分布在編碼區,并預測到119個開放閱讀框。另外與OSGIVRBIV進行序列比對發現,它們的序列相似度達到99%,推測可能是同一病毒菌株的變異,在RBIV-C1基因組中發現了11個插入突變,13個缺失,103SNP位點,這些變異位點可成為RBIV-C1鑒定的依據。通過進一步的qPCR全基因轉錄模式分析,顯示119個開放閱讀中有118個在活體感染時表達,并根據它們的表達模式,將其分為3個系統聚類,這一結果為細胞腫大病毒屬的基因性能和基因表達特性的研究提供了新的參考。

                            原文索引:[ Zhang B C, et al. Complete genome sequence and transcription profiles of the rock bream iridovirus RBIV-C1. Dis Aquat Org, 2013, 104: 203-214.]

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