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                            高通量測序分析(微生物菌群分析、微生物多樣性分析、微生物群落分析)

                            高通量測序分析環境微生物(微生物菌群分析、微生物多樣性分析、微生物群落分析)

                            資費:請電話商談 聯系電話:01065945597/65919547
                                                  手機:13717768726

                            研究對象

                            樣品來源:土壤、海洋、活性污泥、動物腸道、糞便、酒曲、窖泥、發酵液、菌劑、食品等;

                            樣品形式:環境樣品、基因組DNA、PCR產物;

                            方案設計

                            根據客戶提供的樣本(環境樣本、基因組DNA、PCR產物)及需要檢測的微生物多樣性類型(細菌、古菌、真菌),利用Roche 454測序平臺對目的片段進行高通量測序,并對測序結果進行生物信息學的分析。

                            技術流程:
                             
                            生物信息學分析:

                            測序完成后對序列進行數據統計分析及基礎的生物信息學分析,并可根據客戶要求提供個性化分析服務(詳情可參考生物信息學分析流程)。

                            生物信息學分析結果展示:

                            有效測序數據

                            多樣品平行測序過程中,各樣品通過Barcode標簽序列區分樣品,而測序所得的原始數據中可能含有沒有任何樣品信息的雜質序列,這些序列極有可能導致后續生物信息錯誤或意義不明。因此,需要先將這些序列從原始數據中移除,并根據樣品標簽篩選有效序列。

                             優化分析數據

                            通常情況下,有效數據可以直接進行后續生物信息分析。如果需要得到更高質量及更精準的生物信息分析結果,將對有效測序數據進行修剪(trim)(去除bacode、primer、過短、過長、出現含糊堿基、含過長homologous及重復的序列),修剪后得到的數據即為優化數據。該過程可能出現拋棄一定量數據的情況,但可以保證得到更高質量的信息分析。

                             

                            各樣品序列數據統計

                            根據樣品標簽序列將待分析的序列分配到各樣品中。

                            OTU生成

                            OTU(Operational Taxonomic Units)是數值分類最低等級的分類單位。有種、變種、個體等,在作群體分析時,根據相似系數值在一定標準進行歸納整理和聚類。在生物信息分析中,測序得到的每一條序列來自一個細菌。要了解一個樣品微生物組成信息,就需要將序列按照彼此的相似性進行歸類,每一類就是一個OTU。目前根據文獻報道,通常按照96%-98%進行OTU的劃分,也可根據客戶指定的相似度或者微多樣性出現時的相似度劃分OTU,并對OTU進行生物信息統計分析,但是OTU劃分和物種分類是不完全對應的。

                            多樣性評估(Estimator

                            多樣性指數:Shannon—Wiener指數,Simpson指數;

                            豐富豐度指數:Chao1 ACE

                            測序的飽和度:Good’s coverage

                            稀疏曲線 Rarefaction curve

                            Rarefaction即取樣深度,是比較測序量不同的樣本之間的物種豐富度,通過各樣品的測序量及在不同測序深度的OTU數目構建稀疏曲線,以此反映單個樣本測序數量對應的物種豐度。

                            全樣品相似度分析

                            比較多個樣品的OTU差異及各OTU中含有序列的多少,可以得到這些樣品的相似關系。

                            顯著性差異分析

                            分析多個樣品時,如果這些樣品分屬于兩種環境情況下,則可以進行Metastats分析。該分析通過對比兩組條件下的多個樣品,找出兩者之間有明顯差異性表達的因子。

                             

                            OTU比較文氏圖

                            按某一相似性劃分OTU,并比較各樣品OTU分布,重合區域為各樣品間共同的OUT

                            分類學分析(Taxonomy

                            序列數據分類(Classify

                            將經過修剪的所有序列都與SILVA106版本)數據庫進行比對,找出與其序列最相近且可信度達80%以上的序列分類信息。之后,按照所劃分的OTU,將每一個OTU中的序列進行類比,找出同一OTU中的不同序列的最近祖先的分類信息。此步驟不僅保留了盡可能多的信息量,又確保了所得信息的準確性。 

                            Heatmap

                            將指定種屬水平上的分類信息按照樣品和分類進行聚類后作出Heatmap圖,即可反映出各樣品在各分類水平上的差異

                            單樣品微生物組成餅圖及柱狀圖

                            對各樣品中的微生物組成及其含量進行分析,并可利用柱狀圖比較不同樣品間微生物組成的差異。

                             PCA分析(Principal Component Analysis)

                            PCA分析,即主成分分析,是一種對數據進行簡化分析的技術,這種方法可以有效的找出數據中最主要的元素和結構,去除噪音和冗余,將原有的復雜數據降維,揭示隱藏在復雜數據背后的簡單結構。我們可以用PCA來分析不同樣品OTU組成的差異,通過方差分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上,坐標軸各取能夠最大反映方差值的兩個特征值。若樣品組成越相似,反映在PCA圖中的距離越近。

                            UniFrac分析

                            UniFrac 是一種利用各樣品中微生物序列間的進化信息計算樣品間距離,兩個以上的樣品,則得到一個距離矩陣,并通過多變量統計學方法PCoA(principal co-ordinates analysis)進行處理。從結果中反映出各樣品間微生物群落結構的差異。

                            RDA/CCA分析

                            RDA或者CCA是基于對應分析發展而來的一種排序方法,將對應分析與多元回歸分析相結合,每一步計算均與環境因子進行回歸,又稱多元直接梯度分析。此分析是主要用來反映菌群與環境因子之間關系。RDA是基于線性模型,CCA是基于單峰模型。

                            圖標注釋:箭頭表示環境因子,箭頭所處的象限表示環境因子與排序軸之間的正負相關性,箭頭連線的長度代表著某個環境因子與研究對象分布相關程度的大小,連線越長,代表這個環境因子對研究對象的分布影響越大。箭頭連線與排序軸的夾角代表這某個環境因子與排序軸的相關性大小,夾角越小,相關性越高。

                             

                            環境微生物多樣性分析送樣要求:

                            環境樣品送樣要求

                            1)         環境樣品

                            2)         采樣后務必立即將樣品封存(冷凍保存,推薦液氮處理)。土壤、糞便、污泥、海水沉積物等樣品量需>1g,植物樹枝葉片、堆肥等樣品量需>100g

                            3)         樣品保存期間切忌反復凍融。

                            4)         送樣時使用干冰運輸。

                            5)         請填寫完整的送樣訂單,用自封袋密封后隨同樣品一起送樣。

                            基因組DNA送樣要求

                            1)         請提供OD值介于1.82.0之間,濃度>10ng/μl,總量>200ngDNA,并確   DNA無降解。

                            2)         送樣管務必標清樣品編號,管口使用Parafilm膜密封。

                            3)         樣品保存期間切忌反復凍融。

                            4)         建議送樣時使用干冰運輸。

                            5)         請填寫完整的送樣訂單和DNA電泳檢測照片(濃度、總量和純度必須符合送樣要求),用自封袋密封后隨同樣品一起送樣。

                            PCR產物送樣要求

                            1)         請按照寶杰羅生物提供的PCR實驗要求來進行引物設計和PCR擴增。

                            2)         PCR產物濃度>10ng/μl,總量>200ngOD260/2801.8左右。

                            3)         PCR產物需經瓊脂糖電泳切膠回收純化。

                            4)         送樣管務必標清樣品編號,管口使用Parafilm膜密封。

                            5)         樣品保存期間切忌反復凍融。

                            6)         送樣時使用干冰運輸。

                            7)         請填寫完整的送樣訂單,并提供PCR產物純化前后的電泳檢測圖片,用自封袋密封后隨同樣品一起送樣。

                            試驗周期

                            接到樣本后30-40 個工作日

                            參考文獻

                            Wu, S., G. Wang, et al. (2012). "Composition, diversity, and origin of the bacterial community in grass carp intestine." PLoS One 7(2): e30440.

                            Tingting wang, et al., (2011).” Structural segregation of gut microbiota between

                            colorectal cancer patients and healthy volunteers” ISME: 1-10.

                            Jiangchao Zhao, et al., (2012). “Decade-long bacterial community dynamics in cystic fibrosis airways” PNAS 109 (15): 5809-5804.

                             

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